В кино Мифунэ начинал как помощник оператора. Первые фильмы с его участием вышли в 1947 году — «Время новых дураков» Кадзиро Ямамото и «По ту сторону серебряного хребта» Сэнгити Танигути. 

На съемках второго фильма он познакомился с Акирой Куросавой. В 1948 году вышел фильм Куросавы «Пьяный ангел», где Мифунэ сыграл главную роль — молодого гангстера Мацунагу. С этого фильма началось многолетнее сотрудничество актера и режиссера.

Международная слава пришла к ним обоим после фильма «Расемон» (1950) по рассказу классика японской литературы Акутагавы Рюноскэ «В чаще», где Мифунэ сыграл роль разбойника Тадземару. В 1951 году Куросава экранизировал роман Достоевского «Идиот», перенеся сюжет в Японию. 

Фильм «Семь самураев», вышедший на экраны в 1954 году, стал одной из самых важных картин в творчестве как Мифунэ, так и Куросавы. В истории о том, как семь бедных самураев защищают деревню от бандитов, Мифунэ сыграл роль самурая-самозванца Кикутие. 

Мифунэ много снимался и у других режиссеров. В частности, он трижды воплотил в кино образ легендарного фехтовальщика Миямото Мусаси. 

Во второй половине 50-х активно выходят новые фильмы творческого тандема Куросава — Мифунэ: «Трон в крови» (1957), «На дне» (1957), «Три негодяя в скрытой крепости» (1958), «Телохранитель» (1961). 

В 1962 году актер основал кинокомпанию «Mifune Production», существующую и по сей день. Последней совместной работой Куросавы и Мифунэ стала драма «Красная борода» (1965).

 С начала 1960-х Мифунэ активно снимается в европейском и американском кино. В вестерне Теренса Янга «Красное солнце» Мифунэ играет самурая из свиты японского посла, а его партнеры по фильму — Чарльз Бронсон и Ален Делон — бандитов с Дикого Запада.

В 1979 году он снимается в роли командира японской подлодки в сатирической комедии Стивена Спилберга «1941», а в 1980 году — в четырехсерийном фильме «Сегун», где снова воплощает образ самурая в роли дайме Торанаги.